Londonban, kórházban dolgozott fiziológusként és biológusként 1899-1902-ig, majd az Ohio-i Clevelandben működő Western Reserve University élettanprofesszora volt 1903-1918-ig. 1918-tól a Torontói Egyetem orvosi karának dékánhelyettese, majd élettani laboratóriumának igazgatója lett. Legfőbb kutatási területe a szénhidrát-anyagcsere volt. Az ő laboratóriumában folytatott, Bantinggel és Charles Besttel közösen végzett kutatások vezettek az inzulin izolálásához 1921-ben. Az eljárás kidolgozásában részt vett J. B. Collip biokémikus is. Eredményeiért 1923-ban Macleod Bantinggel megosztva orvosi-élettani Nobel-díjat kapott. A díj rá eső összegének felét Macleod Collipnak engedte át, Banting hasonlóképpen az általa kapott összeget Besttel osztotta meg. A későbbiekben Macleod az idegrendszernek a magas vércukorszintben játszott szerepét kutatta. 1928-ban visszatért Skóciába, itt az Aberdeen-i egyetem professzora volt haláláig.