1793 és 1800 között a Manchester-i "New College"-ben tanított, majd magántanítványok oktatásából tartotta fenn magát. 1800-tól a Manchester Literary and Philosophical Society titkára, majd 1817-től haláláig elnöke volt. Számos eredményéről a társaságban tartott előadásaiban számolt be. Tudományos érdeklődése igen sokrétű volt. Hatalmas mennyiségű meteorológiai megfigyelést végzett. Jelentős kutatásokat végzett - saját színvaksága miatt is - a színvakság és színtévesztés területén. A vörös és zöld színek összetévesztését ma is nevezik daltonizmusnak az orvosi szaknyelvben. A kémiai atomelmélet jelentős képviselője volt, ő fogalmazta meg a többszörös súlyviszonyok törvényét. Róla nevezték el az atomi tömegegységet daltonnak. Fontos eredménye a tökéletes gázok elegyeiben a parciális nyomásra vonatkozó Dalton-törvény. A Royal Society tagjává választotta, 1826-ban megkapta a társaság aranyérmét. A Francia Tudományos Akadémia levelező tagja volt.