A zürichi műegyetemen tanult, majd a Strassburgi (ma Strassburg, Franciaország; 1876-79), a Giesseni (1879-88), a Würzburgi (1888-1900) és a Müncheni Egyetem (1900-20) fizikaprofesszora volt. Rugalmasságtani vizsgálatokkal, a hajszálcsövesség jelenségeivel, a gázok fajhőjével, a kristályok hővezetésével, a gázok hőelnyelésével és a piezoelektromossággal is foglalkozott.
Röntgen 1895-ben azt vizsgálta, hogyan folyik az elektromos áram
légritkított üvegcsőben (katódsugárcsőben). Kísérletei közben figyelt fel
arra, hogy amikor a katódsugárcsú működik, a közelben lévő
bárium-cianoplatinát anyagdarab fényt bocsát ki. Úgy gondolta, hogy amikor a
katódsugarak (elektronok) a cső falába ütköznek, valamilyen ismeretlen
sugárzás jön létre, ez a sugárzás áthalad a szobán, beleütközik a vegyi
anyagba és fluoreszkálásra készteti. További vizsgálatokkal feltárta, hogy a
papír, a fa, az alumínium és más anyagok átlátszóak az új sugárzás számára.
Felfedezte, hogy a sugárzás megfeketíti a fényképlemezt. Tévesen úgy vélte,
hogy a sugárzásnak nincs köze a fényhez, mert nem mutatott észrevehető
fényszerű tulajdonságokat, nem verődött vissza, nem tört meg.
Meghatározhatatlan jellege miatt X-sugárnak nevezte el, de a jelenség idővel
az angol nyelvterületen kívül röntgensugár néven vált ismertté. Röntgen
fémtárgyak belsejéről és felesége kezéről készítette az első
röntgenfelvételeket.