Az Oregoni Állami Mezőgazdasági Egyetemen (ma Oregoni Állami Egyetem) 1922-ben kapta kézhez vegyészmérnöki diplomáját, majd a Kaliforniai Műszaki Egyetem demonstrátora lett Pasadenában. Miután doktorátust szerzett fizikai kémiából (1925), két évig Európában, a legnagyobb tudósok laboratóriumaiban dolgozott (Arnold Sommerfeldnél Münchenben, Niels Bohrnál Koppenhágában, Erwin Schrödingernél Zürichben és Sir William Henry Braggnél Londonban). 1927-ben tért vissza a Kaliforniai Műszaki Egyetemre docensként, 1931-ben kinevezték egyetemi tanárrá, 1936 és 1958 között pedig a Gates and Crellin Laboratories of Chemistry igazgatója volt.
Kémiai kutatásai középpontjában az egyszerű vegyületektől a fehérjékig terjedő molekulák szerkezeti problémái álltak, amelyek tanulmányozására az elsők között alkalmazta a kvantummechanikai elveket. Röntgen- és elektrondiffrakciós, mágneses mérések eredményeiből és a vegyületek képződéshőiből számította ki az atomok közötti kötéshosszakat és a kémiai kötések közötti szögeket. (A röntgendiffrakció a röntgensugarak útvonalának megváltozása az atomokkal vagy atomcsoportokkal lejátszódó ütközés nyomán; az elektrondiffrakció az elektronsugár és az atomok közötti ütközés eredménye.) Összefüggést állapított meg a kötéshosszak és -szögek, valamint a molekulák tulajdonságai és a köztük lévő kölcsönhatások között.
A szénatom körüli négy kötés egyenértékűségének leírására bevezette a hibrid pályák fogalmát (a hibrid pályákon az elektronpályák a kölcsönös taszítás miatt elmozdulnak eredeti helyzetükből), és felismerte, hogy ilyenek alakulnak ki azoknak az ionoknak vagy ioncsoportoknak a koordinációs képződményeiben, amelyek adott geometriai elrendezésben vesznek körül egy központi iont. Korábbi munkája alapján kidolgozta az irányított (pozitív vagy negatív) vegyérték elméletét és a kovalens (közös elektronpárokkal képzett) kötések részleges ionos jellegének teóriáját. Az elektronegativitás, a kovalens kötésben érvényesülő elektronvonzó képesség Pauling-féle empirikus felfogása elősegítette az említett problémák tisztázását. Arra az esetre, amikor egy vegyület molekulái nem írhatók le egyértelműen egyetlen szerkezettel, Pauling bevezette a rezonáns hibridek fogalmát; eszerint a molekulaszerkezet két vagy több adott szerkezet közötti átmenetnek tekinthető. A rezonanciaelméletet élesen, de sikertelenül támadták a Szovjetunióban 1951-ben: a kommunista párt szemellenzős tudósai azzal érveltek, hogy ellentmond a dialektus materialista elveknek. Pauling pályája elején fokozatosan dolgozta ki kötéselméletét. Eredményeit folyóiratcikkekben közölte, és a The Nature of the Chemical Bond, and the Structure of Molecules and Crystals (A kémiai kötés elmélete, valamint a molekulák és kristályok szerkezete; 1939) c. könyvében összegezte. Az 1937 és 1938 közötti előadásai alapján született mű a század egyik legalapvetőbb tankönyvének bizonyult.
A molekulaszerkezetről szerzett ismereteket 1934-ben kezdte alkalmazni az élő szövet bonyolult molekuláira, elsősorban a fehérjékre. A hemoglobinmolekula oxigénfelvétel során mutatott mágneses szuszceptibilitását (mágnesezhetőségének mértékét) tanulmányozva olyan kutatásokat indított el, amelyek a természetes, a denaturált és a koagulált fehérjék elméletéhez vezettek. (A természetes fehérjék az élő szervezetben található aktív fehérjék; a denaturált fehérjékben hő vagy kémiai hatás következtében néhány kötés felhasadt; a koagulált fehérjék molekulái megszilárdultak). Felkeltették figyelmét az immunreakciókban szereplő fehérjék is, és 1940-ben Max Delbrück német származású biológussal együtt kidolgozta az antitest-antigén reakciók molekuláris komplementaritásának elméletét. Pauling felismerte, hogy a hidrogénkötés fontos szerepet tölt be a fehérjék szerkezetében és a makromolekulák közötti kölcsönhatásokban. Amerikai vegyésztársával, Robert B. Coreyval vizsgálta a fehérjéket alkotó aminosavak és polipeptidek szerkezetét, és ennek alapján ismerte fel, hogy bizonyos fehérjék spirális szerkezetűek.
Az 1940-es évek végén Pauling a sarlósejtes vérszegénységet tanulmányozva tudta meg, hogy a vörös vértestek csak a vénás vérben veszik fel a rendellenes sarlóalakot. Megsejtette, hogy a deformációt a hemoglobin képződésével összefüggő genetikai károsodás okozza. Kimutatta, hogy az artériás vérben az oxigén gátolja meg a sarlóalak létrejöttét.
Molekuláris modellt dolgozott ki az érzéstelenítés magyarázatára, amelyet 1961-ben publikált; tanulmányozta az emlékezés folyamatát; és 1965-ben olyan elméletet állított fel az atommag leírására, amely bizonyos szempontból jobb a többi modellnél. Tudományos pályáját az intuitív sejtések jellemezték, és segítségére volt rendkívüli memóriája, amellyel a kémiai ismereteket fejben tartotta.
A nukleáris fegyverek kifejlesztése után Paulingot komolyan aggasztotta a fegyverek kipróbálásával járó sugárzási veszély lehetősége. Nézeteit a No More War! (Ne legyen több háború!; 1958) c. könyvében fejtette ki. 1958 januárjában petíciót nyújtott be az ENSZ-nek a kísérleti atomrobbantások leállítása érdekében. A kérvényt a világ 11 021 tudósa írta alá. Pauling 1963-ban a Santa Barbara-i Center for the Study of Democratic Institutions munkatársa lett, ahol elsősorban a háború és béke kérdéseit tanulmányozta. Nem indokolták hivatalosan, miért kapta meg 1963-ban az 1962. évi Nobel-békedíjat, de minden bizonnyal az 1963-ban megkötött atomcsendegyezmény létrehozásában játszott szerepéért tüntették ki.
A kaliforniai kormányzó oktatáspolitikája elleni tiltakozásként Pauling 1969-ben lemondott a Kaliforniai Egyetemen, San Diegóban két éve viselt tisztségéről, és a Stanford Egyetem kémiai tanszékén folytatta kutatásait. 1973-ban megalapította a Linus Pauling Institute of Science and Medicine-t, ahol azt kívánta tanulmányozni, hogyan előzhetők meg és kezelhetők a betegségek optimális mennyiségű vitamin és ásványi anyag bevitelével, elsősorban naponkénti C-vitamin megadózis (6-18 g) adagolásával. Nézeteit a Vitamin C and the Common Cold (A C-vitamin és a közönséges nátha; 1970), a Cancer and Vitamin C (A rák és a C-vitamin; 1979) és a How to Live Longer and Feel Better (Hogyan éljünk tovább és hogyan érezzük magunkat jobban; 1986) c. könyveiben fejtette ki.
A két Nobel-díjon kívül is sok elismerést
kapott tudományos és pacifista körökben. Tudományos
sikerét annak köszönhette, hogy gyorsan átlátta
az új problémákat, felismerte a jelenségek
közötti kapcsolatokat, és bátran hangoztatta a
hagyományostól eltérő nézeteit. Bár
nem minden elképzelése volt helyes, felvetései mindig
vitákat és kutatásokat indítottak el.