James Orr Fleminggel 1877-ben kötött házassága boldogtalannak bizonyult. 1878-ban Bostonba költözött, s 1879-ben Edward C. Pickeringnek, a Harvard College Obszervatórium igazgatójának a házvezetőnője lett. 1881-ben vették fel az obszervatóriumba munkatársnak. A következő harminc évben közreműködött a csillagszínkép-felvételek osztályozásában, 1898-ban a Harvardon a csillagászati fényképek gondnokává nevezték ki.
Fleming főként a csillagszínképek osztályozásával kapcsolatos munkájáról ismert. A Pickering-Fleming-rendszer néven ismertté vált technikával a kutatónő az égi felvételek tízezreit tanulmányozta. Ezeket a New York-i amatőr csillagász, Henry Draper emlékének szentelt program keretében készítették. Munkája során 10 nóvát, 52 csillagködöt és több száz változócsillagot fedezett fel. A csillagok változó fényességének mérésére ő alkotta meg a magnitúdó (látszó fényesség) első fényképészeti szabványát.
Legjelentősebb munkái közé tartozik a Draper Catalogue of Stellar Spectra (A csillagszínképek Draper-katalógusa; 1890), A Photographic Study of Variable Stars (A változócsillagok tanulmányozása fényképészettel; 1907) és a Stars Having Peculiar Spectra (Különös színképű csillagok; 1912).
Fleminget 1906-ban tagjává választotta a Királyi
Csillagászati Társaság; az első amerikai nő
volt a tagok között.