Előbb a Valenciai Egyetem leíróanatómia-professzora (1884-87), majd a Barcelonai (1887-92) és a Madridi Egyetem (1887-1922) szövettan- és kórbonctan-professzora volt. Tökéletesítette a Golgi-féle ezüstnitrát-festéses eljárást (1903), majd aranyfestéses eljárást dolgozott ki (1913), hogy segítse az embriók és a fiatal állatok agyából, érzőközpontjaiból és gerincvelejéből származó idegszövetek finomabb szerkezetének a tanulmányozását. Ezek az idegsejt-specifikus festési eljárások tették lehetővé számára, hogy meghatározza a szem ideghártyájának finomszerkezetét, ill. megismerje az agyi szürkeállomány és a gerincvelő idegsejtjeinek szerkezetét és kapcsolódásait. Szövetfestési módszereinek fontos szerep jutott az agydaganatok diagnosztizálásában is.
XIII. Alfonz spanyol király 1920-ban rendelkezett a madridi Cajal Intézet létrehozásáról; Ramón y Cajal haláláig itt dolgozott. A Magyar Tudományos Akadémia 1901-ben tiszteleti tagjává választotta.