Audubont, egy francia kereskedő, ültetvényes és rabszolgakereskedő, valamint egy kreol nő törvénytelen gyermekét - akinek törvénytelen féltestvére is a Nyugat-Indiákon született - apja 1794-ben örökbefogadás révén törvényesítette, öt évvel azután, hogy visszatért Franciaországba. Audubon Franciaországban töltött gyermekkorában kezdett érdeklődni a madarak rajzolása iránt. Tizennyolc éves korában Amerikába küldték, hogy elkerülje a katonai szolgálatot és bekapcsolódjék az üzleti életbe. Ebben az időben kezdte Észak-Amerika madárvilágának tanulmányozását, amely végül Floridából Labradorba (Kanada) vitte. Frederick Rozier-vel társulva először egy bányát próbáltak üzemeltetni, majd vegyeskereskedéssel kísérleteztek Louisville-ben (Kentucky), később Hendersonban (Kentucky), de a teljes sikertelenséget követően a társulást felbontották. Audubon később sógorával is belekezdett néhány üzleti vállalkozásba, de ezek sem voltak eredményesek. 1820-tól kezdődően bármely munkát elvállalt, amely biztosította megélhetését és lehetővé tette, hogy a madarak rajzolása iránti egyre növekvő érdeklődésére összpontosíthasson. Egy ideig állatkitöméssel foglalkozott, majd portrékat készített és rajzot tanított. Ezalatt felesége nevelőnőként dolgozott.

1824-ben kezdett foglalkozni a gondolattal, hogy madarakról készített rajzait megjelentesse, de azt a tanácsot kapta, hogy Európában keressen kiadót, mert ott jobb metszetkészítőket talál, és a téma iránt is nagyobb az érdeklődés. 1826-ban utazott Európába, hogy támogatókat és kiadót keressen. Művei tetszést arattak Edinburgh-ban, majd Londonban is, miután a király is rendelt könyveiből. Robert Havell londoni rézmetsző vállalta képeinek kiadását; a mű címe The Birds of America (Amerika madarai; 1827-37), 4 kötet, 435 kézi festésű metszet. A kísérőszöveget William MacGillivray segítségével írta az Ornithological Biography (Ornitológiai biográfia; 1831-39) c. 5 kötetes műhöz, ill. megjelent az A Synopsis of the Birds of North America (Észak-Amerika madarainak áttekintése; 1839) is, egy kötet, amely mutatóként szolgál az előző kötetekhez. 1839-ig Audubon részben Európában, részben Amerikában élt, anyagot gyűjtött, további illusztrációkat készített, műveit megrendelésekből finanszírozta. Miután hírnevét megalapozta, New Yorkban telepedett le, és elkészítette a Birds of America (Amerika madarai; 1840-47; 7 kötet) rövidített kiadását. Emellett egy új munkája is született Viviparous Quadrupeds of North America (Észak-Amerika elevenszülő négylábúi; 1845-48), 3 kötet, 150 metszet, amelynek kísérőszövegét fiai és a természetkutató John Bachman fejezték be (1846-53; 3 kötet).

Az Audubon munkáival kapcsolatos kritikák elsősorban bizonyos elképzelt (vagy inkább lehetetlen) beállításokra és pontatlan részletekre mutattak rá, de azok művészi értékeit kevesen vitatták. Sokak számára Audubon munkássága messze felülmúlta Alexander Wilsonét, a kortárs (és nála tudományosabb) ornitológusét.